核酸濃度檢測（二）——讀數(shù)解讀及注意事項(xiàng)

當(dāng)我們獲得了Micro Drop超微量分光光度計(jì)檢測結(jié)果后，對光譜的正確分析至關(guān)重要。

輸出結(jié)果的含義：

1. A260nm——核酸zui高吸收峰的吸收波長。

2. A280nm——蛋白zui高吸收峰的吸收波長。

3. A230nm——是碳水化合物zui高吸收峰的吸收波長。

4. A340nm——是基線校準(zhǔn)波長，為檢測溶液樣品的濁度和其他干擾因子。該值應(yīng)該接近0.0。如果不是，表明溶液中有懸浮物，需要純化樣品。純樣品的A340一般是0。

●   A230產(chǎn)生負(fù)值主要是由于在很低 DNA 濃度的溶液中的一些其他成分的干擾所導(dǎo)致的。在下一個(gè)測定中，需要降低樣品的稀釋度，A230的負(fù)值會被校正。

●   A260/A280比值可進(jìn)行核酸樣品純度評估：純DNA的A260/A280比值為1.8，純 RNA的A260/A280比值為2.0。如果比值低，表示受到蛋白（芳香族）或酚類物質(zhì)的污染，需要純化樣品。

●   A260/A230比值可進(jìn)行核酸樣品純度評估：純 DNA和RNA的A260/A230比值為 1.8 – 2.2。若比值小于1.8表明樣品被碳水化合物（糖類）、鹽類或有機(jī)溶劑污染，需要純化樣品。當(dāng) 260/230<1 時(shí)，通常只有兩種情況。一是胍鹽污染，二是蛋白污染。

樣本的不同提取方法對檢測的影響: 

●   苯酚/ Trizol萃取——殘留試劑污染可以通過220至240nm之間的異常光譜以及260至280nm區(qū)域的偏移來表示。

●   純化柱提取——殘留胍可能有助于230nm附近的峰值和從230nm到240nm的波谷偏移。

●   磁珠法提取——殘余珠可能會導(dǎo)致光散射，并導(dǎo)致異常光譜。

操作注意事項(xiàng): 

1. A260/A280、A260/A230比值受溶液酸堿度及離子強(qiáng)度的影響，如酸溶液會使A260/A280比值降低，低離子強(qiáng)度和低 pH 溶液會增加 280 nm 處的光吸收值。因此必須確保空白檢測和溶解樣品所用Buffer的離子濃度和pH值一致。

2. 濃度接近2 ng/μl濃度的樣品可能會導(dǎo)致不可靠的260/280和/或260/230的比值。

3. 樣品的稀釋濃度同樣是不可忽視的因素，由于樣品中不可避免存在一些細(xì)小的顆粒，尤其是核酸樣品。這些小顆粒的存在會干擾測試效果。樣品的濃度不能過低，或者過高（超過光度計(jì)的測試范圍）。

4. 樣品混合要充分，否則吸光值太低，甚至出現(xiàn)負(fù)值；混合液不能存在氣泡，空白液無懸浮物，否則讀數(shù)漂移劇烈。樣品混合不均勻會直接導(dǎo)致檢測不確定，重復(fù)性低。

5. 樣品檢測上樣量不能太少，必須能夠保證能后連接上下兩根光纖形成光柱，從而使得檢測正常進(jìn)行。

6. 樣品臺清潔，在檢測前，檢測后以及連續(xù)使用儀器30分鐘后均需要對上下接觸樣品的部位用雙蒸水或純水擦拭。

7. 切忌不可用噴壺在樣品臺上噴射，以防液體液體進(jìn)入儀器內(nèi)部造成損壞。

8. 切忌不可用洗滌劑或異丙醇清潔基座。

9. 儀器放置位置應(yīng)當(dāng)遠(yuǎn)離通風(fēng)口，以免液滴蒸發(fā)太快導(dǎo)致濃度讀數(shù)偏大。